近日，1例71岁男性患者，送检肿瘤组织石蜡切片+口腔拭子样本，检测胶质瘤680基因变异和染色体7/10拷贝数变异项目。NGS检测结果提示，IDH1/2变异阴性、1p/19q联合缺失阴性、TERT启动子突变阳性、EGFR扩增阳性、CDKN2A/B缺失阳性、PTEN变异阳性、7+/10-阳性、MGMT启动子甲基化阳性。其中，染色体7号获得和10号缺失变异，经FISH方法验证。

图1 绘真医学胶质瘤基因检测结果及分子分型提示

图2 CNV-seq检出染色体7+/10-变异以及FISH验证结果

结合该患者病理报告结果：（右侧丘脑）考虑为胶质母细胞瘤（CNS WHO 4级），建议做分子检测进一步明确诊断。根据胶质瘤整合和分层诊断规则，建议考虑该患者为胶质母细胞瘤，IDH野生型，CNS WHO 4级。这表明，分子检测与病理诊断结果一致，提示该患者预后较差，后续治疗需要按照指南推荐的胶质母细胞瘤的方案进行。

图3 患者病理报告，建议分子检测进一步明确诊断

一、染色体拷贝数变异与胶质瘤分类分级

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类推荐成人弥漫胶质瘤患者检测染色体1p/19q、7/10拷贝数变异，用于辅助临床诊断及精准分级。

该分类认为，无论组织学形态是否表现为少突胶质细胞瘤特征，弥漫性胶质瘤如果同时存在IDH1/2突变和1p/19q共缺失，即可定义为少突胶质细胞瘤，IDH突变和1p/19q共缺失型。另外，胶质母细胞瘤，IDH野生型的范畴包括同时具有发生于成人、弥漫性生长、星形细胞肿瘤特征，并具有血管增生或坏死、TERT启动子突变、EGFR扩增、染色体7+/10-之任一分子特征^[1]。《脑胶质瘤诊疗指南》推荐FISH、NGS(二代测序)等方法检测染色体1p/19q共缺失，以及染色体7+/10-拷贝数变异^[2]。

图4 胶质瘤指南推荐FISH、NGS等方法检测染色体1p/19q、7/10拷贝数变异

二、染色体拷贝数变异检测方法学比较

染色体拷贝数变异是指染色体数目异常和片段重复/缺失。人类染色体属于二倍体，其拷贝数变异通常表现为以下几种：两条同源染色体同时出现缺失；1条发生缺失，1条正常；1条发生获得，1条正常；1条发生缺失，1条同时获得；2条同时发生获得。

目前，常见的染色体拷贝数变异检测方法有核型分析、荧光原位杂交（FISH）、染色体微阵列分析、低深度全基因组测序（CNV-seq）等方法。每种方法学检测原理不同，各有优劣。

核型分析是以分裂中期染色体为研究对象，借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，分析染色体的结构和数目变异。具有成本低，可以检测结构变异等优势，但需要细胞培养，检测周期长，且分辨率有限，仅5-10Mb,低于5Mb的异常检测能力有限。

FISH是用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检样本中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。检测周期短，可以检测长度100Kb左右DNA序列的拷贝数缺失或获得，但仅限于已知目的基因序列，无法检测探针所覆盖区域以外的异常。

染色体微阵列分析方法根据芯片设计与检测原理的不同，又分为基于微阵列的比较基因组杂交（aCGH）和单核苷酸多态性微阵列（SNP-array）。前者是将待测DNA和对照DNA样本用不同荧光染料标记，混合后与芯片上DNA探针杂交，然后比较分析待测DNA和对照DNA的信号强度。后者仅用待测DNA样本与芯片上DNA探针杂交，通过探针信号强度计算分析染色体拷贝数变异。该方法分辨率较高，可以检测杂合性缺失、单亲二倍体和嵌合体，但无法检测探针未覆盖区域。

CNV-seq是基于二代测序技术，对样本DNA进行低深度全基因组测序，将测序结果与人类参考基因组碱基序列进行比对，生信分析染色体拷贝数变异。该方法具有高通量、灵敏度高（50Kb）、周期短等优势，但无法检测单亲二倍体以及多倍体。

图5 aCGH和CNV-seq检测原理比较^[3]

三、与FISH相比，CNV-seq检测染色体拷贝数变异更能提示患者预后

胶质瘤患者携带7号染色体获得和10号染色体缺失，有多种形式。一项临床研究发现，939例患者染色体拷贝数变异，其中97例为7号染色体完全获得以及10号染色体完全缺失（7+/10-），9例为7号染色体完全获得以及10号染色体长臂缺失（7+/10q-），3例为7号染色体短臂获得以及10号染色体完全缺失（7p+/10-），12例为7号染色体长臂获得以及10号染色体完全缺失（7q+/10-）,7例为7号染色体长臂获得以及10号染色体长臂缺失（7q+/10q-），其余为阴性。生存曲线分析表明，携带上述染色体拷贝数变异的胶质瘤患者，预后相对较差^[4]。

图6 不同7/10染色体拷贝数变异胶质瘤患者生存状况

a表示939例胶质瘤患者，b表示167例胶质瘤母细胞瘤，IDH野生型患者

由于其他变异类型患者数量较少，WHO分类要求将整条7号染色体获得同时伴整体10号染色体缺失的胶质瘤患者，结合其他信息，可以考虑为胶质瘤母细胞瘤，IDH野生型，CNS WHO 4级，提示预后较差^[5]。

图7 WHO分类要求检测检测染色体7号和10号整条拷贝数变异，辅助临床诊断

正如上述提到的不同染色体拷贝数变异检测方法，各有优劣。有临床研究表明，与FISH方法学相比，CNV-seq检测胶质瘤染色体拷贝数变异更精准。该研究纳入36例胶质瘤患者组织样本，分别采用FISH和低深度全基因组测序，检测染色体1p/19q缺失变异。检测结果表明，11例患者检出1p/19q的中间缺失和末端缺失，提示FISH检测可能提高1p/19q缺失检测的假阳性率。另外，生存曲线分析发现，与FISH方法相比,CNV-seq检测更能准确提示患者预后^[6]。

图8 与FISH方法相比，CNV-seq检测染色体拷贝数变异能够准确提示胶质瘤患者预后

绘真医学CNV-seq技术的检测性能，已经标准品和真实世界样本的双重验证。与标准品预期结果相比，CNV-seq检测结果完全一致。近百例真实世界临床样本分析发现，CNV-seq检测有较高的灵敏度和特异度。该项目对组织样本的肿瘤细胞占比要求较高，需≥30%，确保检测结果准确可靠。目前，该方法已应用于脑膜瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤等多个癌种的染色体拷贝数变异检测。

参考文献：

[1]王樑,潘亚文,屈延,等.2021年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类(第五版)成人型弥漫性胶质瘤分类解读[J].中国现代神经疾病杂志 2021年21卷9期, 783-790页, ISTIC PKU, 2021.DOI:10.3969/j.issn.1672-6731.2021.09.008.

[2]国家卫生健康委员会医政医管局,中国抗癌协会脑胶质瘤专业委员会,中国医师协会脑胶质瘤专业委员会,等.脑胶质瘤诊疗指南(2022版)[J].中华神经外科杂志, 2022, 38(8):21.

[3]Xie, Chao, and Martti T Tammi. “CNV-seq, a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing.” BMC bioinformatics vol. 10 80. 6 Mar. 2009, doi:10.1186/1471-2105-10-80

[4]Stichel, Damian et al. “Distribution of EGFR amplification, combined chromosome 7 gain and chromosome 10 loss, and TERT promoter mutation in brain tumors and their potential for the reclassification of IDHwt astrocytoma to glioblastoma.” Acta neuropathologica vol. 136,5 (2018): 793-803. doi:10.1007/s00401-018-1905-0.

[5]Brat, Daniel J et al. “cIMPACT-NOW update 3: recommended diagnostic criteria for "Diffuse astrocytic glioma, IDH-wildtype, with molecular features of glioblastoma, WHO grade IV".” Acta neuropathologica vol. 136,5 (2018): 805-810. doi:10.1007/s00401-018-1913-0

[6]Van der Eecken, Kim et al. “Shallow whole-genome sequencing: a useful, easy to apply molecular technique for CNA detection on FFPE tumor tissue-a glioma-driven study.” Virchows Archiv : an international journal of pathology vol. 480,3 (2022): 677-686. doi:10.1007/s00428-022-03268-w.